IPHASE成功研發轉運體OATP1B1、OAT1、OCT2、MATE1、MATE2-K、P-gp！

近年來，人們越來越認識到，除了藥物代謝酶以外，藥物轉運體在許多藥物的吸收、分布和排泄中發揮著重要的作用。由于多態性或藥物-藥物相互作用（DDI）導致的轉運蛋白功能喪失已被證明會導致藥物處置、療效甚至毒性發生顯著變化，進一步強調了藥物轉運體研究的重要性，監管機構也期望新藥申請需進行轉運體的體外研究，以評估轉運蛋白介導的DDI的潛在風險。

轉運體介紹

轉運體（transporter）是一類表達于細胞膜的功能蛋白，在人體全身組織中均有表達，通過影響藥物的吸收、分布和消除而影響藥物的藥代動力學和藥效學特征。介導藥物進入細胞的轉運體可將藥物攝取進入組織器官，從而提升藥物生物利用度以及改變藥物的組織分布，屬于可溶性載體（Solute carrier，SLC）轉運體；介導藥物外排的轉運體可利用水解ATP的能量將某些藥物排出細胞，從而降低細胞內藥物濃度，產生耐藥性，屬于ATP結合盒（ATP binding cassette，ABC）轉運體。

可溶性載體超家族是人類細胞膜上最重要的膜轉運體家族之一，它參與了細胞間的物質運輸、能量傳遞、營養代謝、信號傳導等重要生理活動。SLC超家族包括 52個亞家族，共有 400多名成員。臨床應用中與DDI有關的溶質轉運體大多是攝取型轉運體，包括有機陽離子轉運體（organic cation transporter, OCT)2；有機陰離子轉運體（organic anion transporter, OAT) 1/3；有機陰離子轉運多肽（organic anion transporting polypeptide, OATP) 1B1/1B3；寡膚轉運體（oligopeptide transporter, PEPT)1 等。其中，多藥及毒性化合物外排轉運體（multidrug and toxin extrusion proteins, MATE) 1/2-K 是SLC轉運體，但屬于外排型轉運體。

ATP結合盒（ATP Binding Cassette，ABC）轉運體是最大的轉運體超家族，分為ABCA~G共7個亞家族，屬于主動運輸轉運體，依賴于ATP發揮轉運活性，以逆濃度梯度形式將藥物排出體外。參與藥物轉運的ABC轉運體主要包括P糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)、乳腺癌耐藥蛋白(breast cancer resistance protein，BCRP)、多藥耐藥相關蛋白(multidrug resistance protein，MRP)等。

圖1 藥物轉運蛋白在人體各組織器官中的分布

各國指導原則對轉運體研究的要求

藥物轉運體是決定細胞內藥物積累的關鍵因素，其活性往往與藥物的治療效果、毒性及藥物-藥物相互用 (Drug-drug interaction，DDI) 直接相關。美國、歐洲和中國的藥品監管部門也相繼出臺指導原則，建議體外評估主要轉運體與受試藥物之間潛在的相互作用，為體內研究提供參考。

表1 各國指導原則對轉運體研究的建議

“√"必須考慮；“×"不考慮

轉運體研究體外模型

在開始轉運體研究之前，一個重要的考慮就是選擇合適的體外試驗系統。目前，指導原則推薦的體外評估由轉運體引起的DDI模型主要包括膜囊泡系統、基于極化細胞的雙向轉運系統及單向攝入的細胞系統等。

3.1 膜囊泡系統

轉染轉運體蛋白的細胞的外翻膜囊泡系統是評價在研藥物是否為ABC轉運體（如P-gp、BCRP、BSEP等）的底物或抑制劑的常用模型。通常，膜囊泡可通過感染昆蟲細胞（如Sf9或Sf21），或轉染哺乳動物細胞（如HEK293、HeLa、V79或MDCK）等進行制備。囊泡外翻后，原本表達在胞內的轉運體將被外翻至囊泡外，與藥物共孵育時，藥物直接作用于外翻轉膜上的轉運蛋白，轉運蛋白可以將藥物轉運到囊泡內，可檢測藥物的吸收而非外排，即測定囊泡內藥物含量即可反應轉運體對藥物的作用。

圖2 膜囊泡系統的研究方案

3.2 基于極化細胞的雙向轉運系統

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基于極化細胞的雙向轉運系統是指能夠自發極化形成完整細胞單層的細胞系，如Caco-2、MDCK、LLC-PK1等。將細胞接種在Transwell小室上，培養至形成完整的極化細胞單層，將受試藥物添加到單層細胞的頂端（apical，AP）或基底側（basolateral，BL），測量滲透入接收室中的藥量，根據AP→BL（吸收）和BL→AP（流出）兩個方向上的表觀滲透系數（apparent permeability coefficient，Papp）計算外排率（efflux ratio，ER），評價化合物是否為該ABC轉運體底物。此外，通過測量探針底物在BL→AP方向的凈流量或ER值的變化，也可以進行化合物對特定轉運體抑制作用的評估。

3.3 單向攝入的細胞系統

將重組轉運體基因穩定或瞬時轉染到不同的細胞系，可用于評價在研藥物是否為SLC轉運體（如OCTs、OATs、OATPs和MATEs）的底物或抑制劑。由于HEK293和CHO細胞具有低內源性轉運蛋白活性并且易于維持的特點，常用于表達攝取轉運蛋白。當評價藥物是否為轉運體的底物時，應將轉染細胞中的藥物攝取與親代或空載體轉染細胞系進行比較，且應比較有或無轉運體抑制劑時的藥物攝取。當評估藥物是否為轉運體的抑制劑時，僅使用轉運體轉染的細胞系評價已知探針底物的攝取便已足夠。

3.4三明治培養肝細胞

肝細胞中除了含有豐富的藥物代謝酶，還表達多種重要的轉運體。三明治培養是將肝細胞培養于兩層膠原之間，底層為鼠尾膠使肝細胞貼壁，上層為Matrigen膠使其形成肝板樣結構。培養幾天后，肝細胞形成完整膽小管網絡并同時保持緊密連接，且肝臟轉運體正常表達并定位于恰當的膜區域，可用于轉運體功能研究。

試驗系統——膜囊泡

應用

•評估藥物與外排轉運蛋白（ABC轉運蛋白）的相互作用

•確定底物特異性和確定抑制劑

優勢

•適用于低通透性的化合物

•細胞毒性化合物不會影響實驗系統

•重組系統中的高轉運蛋白表達水平，轉運蛋白表達可以在某些表達系統中“滴定"

•可以制備大量并冷凍保存以備隨時可用

•能夠預加載各種緩沖液和物質

•準確測定動力學，因為孵育緩沖液中的底物可以直接進入活性位點

局限性

•不適合具有高滲透性或高非特異性結合的化合物

•昆蟲細胞中的低糖基化可能改變運輸特性

•表達系統中的內源性運輸活性可能使數據解釋復雜化•轉運蛋白活性因批次而異

•如果在室內制備（超離心或氮空化彈），則需要特殊設備

試驗系統——單向攝入的細胞系統

應用

•評估藥物與攝取轉運蛋白（OATPs,OCTs, OATs，NTCP）的相互作用

•確定底物特異性并確定抑制劑

優勢

•允許調查單個轉運蛋白的特性

•穩定轉染的細胞系可以傳代多次使用或冷凍保存

•低復雜性

局限性

•宿主細胞內源性轉運蛋白活性可能使數據解釋復雜化

•穩定重組細胞系的產生和表征是耗時的（>1個月）

•轉運蛋白表達水平在實驗室之間有所不同

試驗系統——基于極化細胞的雙向轉運系統

應用

•評估外排轉運體的藥物轉運

•確定底物特異性并確定抑制劑

•定性地研究攝取和外排轉運體之間的相互作用

優勢

•運輸受非特異性結合的影響較小，因為只有穿過細胞單層的化合物才被測量

•適合評估主動運輸與擴散

局限性

•內源性轉運蛋白活性可能使數據解釋復雜化

•需要評估質量平衡

•復雜的動力學研究

•除非攝取轉運蛋白共表達，否則不適合低通透性的化合物

試驗系統——肝細胞三明治模型

應用

•評估肝臟攝取/外排和膽道排泄

•識別涉及肝膽藥物處置的轉運蛋白和限速步驟

•評估由于轉運蛋白抑制而引起的藥物性膽汁淤積的可能性

•調查攝取和外排轉運蛋白之間的相互作用

•評估藥物的細胞內濃度、Kpuu和亞細胞分布

優勢

•系統模擬膽汁排泄，可以測量膽道清除率

•表達攝取和外排轉運蛋白、代謝酶和調節機制的整體系統

•可以使用從感興趣的物種中冷凍保存或新鮮分離的肝細胞

•適用于識別轉運蛋白抑制劑（競爭性和非競爭性）和誘導劑

•在臨床前物種和人類中證明了體外對體內的相關性

局限性

•需要一定的培養時間才能在合適的膜域中正確定位轉運蛋白

•不太適合低清除率的化合物（特別是如果涉及代謝）

•酶/轉運蛋白的表達/活性可能會受到培養條件的調節

轉運體研究的關鍵點把控

4.1 ABC轉運體研究的關鍵點

目前，體外評估由ABC轉運體引起的DDI的常用模型為膜囊泡系統、基于極化細胞的雙向轉運系統和三明治培養肝細胞。在實際應用過程中，我們需綜合多方因素，選擇合適的試驗系統。當進行ABC轉運體的體外研究時，以下幾點需要關注：

滲透性和吸附：當評估轉運體是否為在研藥物的底物時，若所測試藥物具有高滲透性或強非特異性吸附等特性，可能會因為背景值較高而造成假陰性的結果。如使用膜囊泡研究具有高滲透性活強非特異性吸附的藥物，可能會因為被動擴散跨膜進入膜囊泡導致高背景，掩蓋轉運體介導的藥物轉運，從而導致在囊泡模型中得到了假陰性的結果。

跨膜能力：如果在研藥物分子量大，不易透過細胞膜時，細胞模型將無法研究藥物的轉運機制，而膜囊泡模型則不受化合物滲透性的影響。藥物跨膜能力較差，能夠進入到細胞內的游離藥物濃度可能較低，而在膜囊泡模型中，藥物可以與轉運體的結合位點直接接觸發揮其作用，并不需要透膜的過程。

輔因子：在設計實驗時，應考慮ABC轉運蛋白對共底物和輔因子的要求。例如，活細胞中以毫摩爾濃度存在的還原性谷胱甘肽是MRP1、MRP2、MRP2和MRP4轉運某些底物所必需的；在某些情況下，谷胱甘肽轉運與藥物轉運有關。因此，試驗中需額外添加適量的還原型谷胱甘肽或s -甲基谷胱甘肽。

4.2 SLC轉運體研究的關鍵點

體外評估由SLC轉運體引起的DDI的常用模型為單向攝入的細胞系。當使用單向攝入的細胞系統進行攝取研究時，以下幾點值得考慮：

溶解度：在試驗設計時，應考慮受試物的溶解度。為增加化合物的溶解度，可在不影響細胞活力或轉運體功能的情況下添加有機溶劑，如二甲基亞砜。對于溶解度低的化合物，可以在孵育緩沖液中加入白蛋白或其他賦形劑，但需要確定化合物處于未結合濃度，否則數據解釋將變得復雜。

試驗程序：為保證試驗結果的準確性，試驗過程需遵循一致的程序，盡量減小試驗誤差導致的影響。攝取速率通常歸一化為細胞總蛋白（mg）或細胞數，以便與親代或空載體轉染細胞的攝取相比，準確測定轉運蛋白特異性攝取。

孵育時間：為了確定受試物的抑制作用，需根據受試物特性，如滲透性、是否為轉運體底物等，考慮其與抑制劑的孵育時間（預孵育和/或共孵育）。

IPHASE轉運體產品

作為體外研究生物試劑引-領者，IPHASE以HEK293為載體，成功推出全面匹配指導原則需求的SLC轉運體細胞（OATP1B1、OATP1B3、OAT1、OAT3、OCT2、MATE1和MATE2-K）、ABC轉運體囊泡（P-gp和BCRP）及配套產品，助力藥物轉運體介導的DDI研究。

參考資料：

[1]洪梅,王旭陽.藥物轉運體的翻譯后處置及相關關鍵位點研究進展[J].華南農業大學學報,2022,43(06):160-172.

[2] Brouwer K L R , Keppler D , Hoffmaster K A ,et al.In vitro methods to support transporter evaluation in drug discovery and development.[J].Clinical Pharmacology & Therapeutics, 2013, 94(1).DOI:10.1038/clpt.2013.81.

[3]《藥物相互作用指導原則2020》

IPHASE/匯智和源憑借多年的研發經驗，推出了多領域、多種類的高-端科研試劑，為藥物早期研發提供篩選工具，為生命科學領域的探索提供新材料、新方法和新手段，為食品、藥品、化學品等的遺傳毒性研究提供便捷產品，望廣大科研工作者咨詢。

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