化妝品控油功效評價之5α-還原酶活性抑制試驗

關鍵詞：Ⅰ型5α-還原酶，Ⅱ型5α-還原酶，肝5α-還原酶，睪丸5α-還原酶，睪酮，二氫睪酮，還原型輔酶Ⅱ(NADPH)，非那雄胺，化妝品控油功效，5α-Reductase，5αR1，5αR2，SRD5A1，SRD5A2，Testosterone，Dihydrotestosterone(DHT)，Finasteride

隨著化妝品行業的功效細分，功效宣稱的規范，消費者對自己皮膚的狀態越來越關注，針對不同膚質也會選擇不同功效的護膚品。當前，皮膚油膩逐漸成為困擾年輕人的主要問題，消費者對于具有控油功效的化妝品的需求呈現日益增長的趨勢。皮膚油膩與皮脂腺細胞過度分泌油脂有關，其中，5α-還原酶（5α-Reductase）是皮膚油脂分泌的一個關鍵限速酶，其活性與皮脂腺的油脂分泌情況有著緊密的聯系。化妝品功效成分如果能夠抑制5α-還原酶活性，則能有效地調節皮脂腺細胞的活性，減少油脂的分泌，從而起到控油的作用。因此，5α-還原酶活性抑制試驗是評價化妝品控油功效的關鍵指標。

01    5α-還原酶簡介

5α-還原酶（5α-Reductase，5αR）是定位于靶細胞微粒體上的膜蛋白，是雄激素睪酮( Testosterone,T)代謝的關鍵酶，共包含Ⅰ型（SRD5A1）、Ⅱ型（SRD5A2）和Ⅲ型（SRD5A3）三種同工酶。其中，Ⅰ型5α-還原酶（5αR1）主要分布于肝臟、皮脂腺、汗腺等器官，發揮生理作用的最適pH為6~9；Ⅱ型5α-還原酶（5αR2）主要分布于前列腺、睪丸、附睪、精囊、頭皮毛囊等，作用最適pH為5.5；而Ⅲ型5α-還原酶（5αR3）研究較少，其在難治愈的前列腺癌中過度表達。

5αR可在還原型輔酶Ⅱ(NADPH) 提供電子的條件下將睪酮上4、5位不飽和雙鍵還原，并轉化為更具活性的二氫睪酮（Dihydrotestosterone，DHT）。二氫睪酮作為一種比睪酮更強效的雄激素，可加速人皮脂腺細胞的增殖并促使皮脂分泌亢進，易導致皮膚油膩等問題（圖1）出現，給人們帶來巨大的心理壓力, 影響工作與生活。因此，通過抑制5α-還原酶的活性以減少皮脂分泌來評價化妝品控油功效，并將其運用于控油、痤瘡等醫藥健康產品領域，其具有重要的研究價值和廣闊的市場前景。

圖1 5α-還原酶在皮膚油脂分泌中的作用（來源：基于人5α還原酶活性試驗對化妝品控油原料的篩選）

02    5α-還原酶活性抑制試驗與化妝品控油功效評價

根據化妝品功效宣稱評價項目要求（表1），控油功效宣稱評價方法有三種：人體功效評價試驗、消費者使用測試和實驗室試驗方法，配以文獻數據支持。其中人體功效和消費者測試這兩種方法為人體方法，所需的成本高，周期長。目前市場上認可最多的就是體外實驗室試驗法，實驗室試驗認可的方法有：皮脂腺細胞試驗和5α-還原酶活性抑制試驗。

皮脂腺細胞試驗由于細胞的特性，不宜用低毒性或者高于低毒性的化妝品進行檢測，易使細胞失去活性。因此：5α-還原酶活性抑制試驗是化妝品控油功效評價最常使用的方案。

表1 化妝品功效宣稱評價項目要求

03    IPHASE相關產品

5α-還原酶活性抑制的體外評估方法通常有紫外法、液相色譜-質譜（LC-MS）法、酶聯免疫吸附試驗（ELISA）法、放射性同位素法、熒光法等。其中LC-MS法、同位素法和ELISA法靈敏度高，均可準確測定5αR活性，但價格昂貴，對試驗人員操作技能要求較高；紫外法雖操作簡單，但測定的目標物NADPH對5αR并無專一性，易受到其他酶的干擾而造成檢測偏差。

鑒于此，IPHASE技術人員建立了一種基于可見分光光度法的5α-還原酶活性抑制效果體外評估的方法，該方法基于酶循環原理，提高了檢測靈敏度和特異性。該方法涉及兩步反應，首先5α-還原酶將睪酮代謝為5α-二氫睪酮，接著二氫睪酮在酶的作用下繼續反應，此反應過程中生成的產物在405nm波長處有特異性的峰值，通過檢測該產物在405nm波長處的吸光度變化，用來體現二氫睪酮生成的多少，最終反映5α-還原酶的活性變化，從而評估化合物的抑制效果（圖2）。由于檢測產物在405nm處有特異性的吸收峰，因此不受其他物質的吸光度的干擾，提高了檢測特異性。

圖2 基于可見分光光度法的5α-還原酶活性檢測原理

此外，為更好地滿足不同客戶的需求，IPHASE技術人員在此方法基礎上根據5α-還原酶的類型開發出Ⅰ型(SRD5A1)5α-還原酶抑制率評估試劑盒和Ⅱ型(SRD5A2)5α-還原酶抑制率評估試劑盒，可分別用于Ⅰ型5α-還原酶和Ⅱ型5α-還原酶抑制劑的篩選。

兩種試劑盒的不同主要體現在酶的來源和陽性藥物的選擇上，其中，Ⅰ型試劑盒為SD大鼠肝5α-還原酶和度他雄胺（Dutasteride），Ⅱ型試劑盒為SD大鼠睪丸5α-還原酶和非那雄胺（Finasteride）。此外，試劑盒還包括了睪酮T、NADPH溶液、酶制劑及反應緩沖液等成分，以確保用戶能夠輕松建立反應體系并進行檢測。試劑盒中各組成成分經過嚴格的質量檢測，試驗結果準確、可靠、重現性好。

IPHASE技術人員對陽性抑制劑非那雄胺的抑制效果進行評估，根據試劑盒說明書進行操作，試驗體系中非那雄胺終濃度為62.5ug/ml，睪酮終濃度為5uM，SD大鼠睪丸5α-還原酶終濃度為0.2mg/ml，第一步反應孵育時間為30min，第二步反應的孵育時間為4min。第二步反應后，用酶標儀檢測各組別在405nm處的的吸光度值：

按照下列公式進行抑制率的計算：

代入數值，可得出非那雄胺的抑制率為：

注：陽性對照樣本的抑制率在70%以上，試驗成立。

因此，在試驗初期，本試劑盒提供的方法可作為化合物高通量初篩的一種手段，簡便、高效，試驗結果準確、可靠。

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